本文转自【九章本草】公众号
本期分享的是2024年发表于Acta Pharmaceutica Sinica B上的一篇文章，文章研究了 Glycnsisitin A与转铁蛋白相互作用并促进其与转铁蛋白受体（TFRC）的结合，导致心肌细胞中铁的摄取增加，从而改善心脏功能。
【研究背景】
心力衰竭（HF）是几乎所有心脏疾病的终末阶段，具有高发病率和死亡率。目前的治疗方案多依赖多种药物的联合应用，虽能缓解症状，但无法显著显著延长生存期或改善预后，缺乏针对HF的有效药物干预靶点。铁是人体必需的微量元素，缺乏会导致严重后果。HF患者由于铁元素表达异常和频繁胃肠道出血，体内铁含量降低，即使在没有贫血的情况下也是如此。HF患者常伴随铁缺乏，显著增加死亡率。因此，靶向铁稳态成为治疗心力衰竭的有效策略。
甘草（Glycyrrhiza uralensis）是传统中药中用于治疗心律不齐和心悸的方剂“炙甘草汤”的主要成分，尽管甘草中已分离出多种化学成分（如三萜类、黄酮类、香豆素类和酚酸类），但其对抗HF的生物活性分子尚不清楚。
展开剩余88%【研究方法及结果】
1.化合物提取与鉴定
通过HRESIMS引导的方法，从甘草根中分离出三种新型双环肽Glycnsisitins A、B、C。通过NMR、IR光谱和X射线衍射等方法确定这些双环肽的结构（图1），特别是Glycnsisitin A的绝对构型。
图1 1-3的化学结构和1的X射线晶体结构
在LC-HRESIMS2分析中，发现了一个独特的肽（m/z 967.4191），其碎片包括典型的酪氨酸（136.0755 Da）、缬氨酸（72.0816 Da）和脯氨酸（70.0660 Da）的离子。
通过HRESIMS、NMR和IR光谱等方法，成功鉴定了Glycnsisitin A（1），其分子式为C49H58O13N8。通过NMR光谱进一步确定了其包含八个氨基酸残基（3个Tyr, 2个Val, Gly, Pro, PyroGlu）和两个非肽键（C-C和C-O-C）。
同时，也鉴定了Glycnsisitin B和C的结构，它们的分子式与A相同，但存在细微的化学位移和结构差异。
2.体外实验
在H9C2心肌细胞和原代成年大鼠心肌细胞上进行细胞活力测定，评估Glycnsisitins A-C对阿霉素（DOX）诱导的心肌细胞损伤的保护作用。测量乳酸脱氢酶（LDH）活性和细胞内ATP水平，评估细胞损伤和线粒体功能。使用DCFH-DA和MitoSOX染色检测细胞内和线粒体内的活性氧（ROS）水平。
在H9C2心肌细胞中，Glycnsisitin A显著提高了经DOX处理后的细胞存活率，EC50值为 1.456 μmol/L。
在DOX诱导的原代心肌细胞中，Glycnsisitin A显著减少了细胞死亡和乳酸脱氢酶（LDH）的释放，同时恢复了ATP水平。
通过DCFH-DA和MitoSOX染色检测，发现Glycnsisitin A显著降低了DOX诱导的线粒体ROS生成。
图2 Glycnsisitin A 可防止 DOX 诱导的心脏毒性和 ROS 产生
3.体内实验
建立DOX诱导的急性HF小鼠模型，评估Glycnsisitin A对小鼠生存率、心脏功能和心肌纤维化的影响。通过超声心动图检测左室射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）等心脏功能指标。检测血清中心肌酶标志物（如CK、LDH）和血浆中脑钠肽（BNP、NT-proBNP）的水平 。
在DOX诱导的心力衰竭小鼠模型中，发现Glycnsisitin A显著提高了小鼠的生存率，并呈剂量依赖性。
心脏功能参数：Glycnsisitin A提高了治疗组小鼠的左心室射血分数（EF）和缩短分数（FS），减少了左心室内径（LVIDd），改善了心脏收缩功能，并减轻了心肌纤维化。
生物标志物：Glycnsisitin A显著降低了血清中的肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）活性，同时降低了血浆中的脑钠肽（BNP）和N端脑钠肽前体（NT-proBNP）水平。
图3 Glycnsisitin A 可减轻 DOX 引发的心脏收缩功能障碍和心肌纤维化
4. 作用机制研究
通过RNA测序（RNA-Seq）分析差异表达基因，并进行基因集富集分析（GSEA），确定Glycnsisitin A的作用机制。使用分子对接和表面等离子共振（SPR）技术评估Glycnsisitin A与转铁蛋白（Transferrin）和转铁蛋白受体（TFRC）的结合能力。通过免疫印迹和ELISA方法检测心肌组织中转铁蛋白和TFRC的表达水平及其相互作用。
RNA测序分析发现，经过Glycnsisitin A处理的小鼠有大量差异表达基因，KEGG通路分析显示与心力衰竭相关的基因集显著富集。GSEA分析发现与铁代谢相关的基因集表现出最高的富集水平，表明Glycnsisitin A可能通过维持铁稳态发挥心脏保护作用。Glycnsisitin A与转铁蛋白（transferrin）结合，增强其与转铁蛋白受体（TFRC）的结合亲和力，从而促进心肌细胞对铁的吸收。使用TFRC中和抗体消除了Glycnsisitin A的心肌保护作用，进一步验证了TFRC在Glycnsisitin A机制中的关键作用。
图4 Glycnsisitin A 通过维持心肌铁稳态来减轻 DOX 诱导的心力衰竭
5.分子对接和表面等离子共振（SPR）实验
使用AutoDock Vina软件进行盲对接。保持蛋白质刚性，化合物柔性。分子对接结果显示，glycnsisitin A与转铁蛋白和TFRC均有较强的结合亲和力。
使用Biacore T100仪器进行SPR分析。Glycnsisitin A在转铁蛋白包被的CM5传感器芯片上显示出强烈的响应信号。Glycnsisitin A显著恢复了DOX处理后心肌组织的铁含量，并增加了转铁蛋白和TFRC的蛋白水平。SPR分析进一步验证了glycnsisitin A与转铁蛋白的直接物理相互作用。
实验结果证明了glycnsisitin A与铁转运蛋白和TFRC之间具有显著的结合能力，从而可能通过促进铁转运蛋白与TFRC的结合来增加心肌细胞中的铁摄取。分子对接和SPR实验为glycnsisitin A在调节心肌铁稳态中的作用机制提供了直接的分子水平证据。
图5 Glycnsisitin A 通过增强转铁蛋白与 TFRC 的结合能力来增加心肌铁含量
6.功能拮抗实验
通过使用TFRC中和抗体（NAb-anti-TFRC）阻断了Glycnsisitin A对心肌细胞铁含量和细胞活力的保护作用，进一步验证了glycnsisitin A通过TFRC依赖途径发挥心肌保护作用的机制。
实验发现，阻断TFRC后，Glycnsisitin A的心肌保护作用被显著削弱，表现为心脏功能指标恶化、心肌铁含量降低和ATP水平下降。
【研究结论】
本研究从甘草根中成功发现并鉴定了新型化合物Glycnsisitins A-C，它们具有独特的化学结构，包含特定的氨基酸残基和非肽键连接。其中，Glycnsisitin A被证实对心肌细胞具有显著的保护作用。在细胞实验中，该化合物能有效提高经阿霉素（DOX）处理后的心肌细胞存活率，减少细胞死亡和乳酸脱氢酶释放，同时降低线粒体活性氧（ROS）的生成。在动物模型中，Glycnsisitin A不仅提高了急性DOX诱导的心力衰竭小鼠的生存率，还改善了心脏功能参数，降低了与心力衰竭相关的生物标志物水平。
进一步的研究揭示，Glycnsisitin A的心脏保护作用可能与其维持心肌铁稳态的能力有关。RNA测序和基因集富集分析（GSEA）显示，Glycnsisitin A处理导致与心力衰竭和铁代谢相关的基因集显著富集。分子对接和表面等离子共振分析表明，Glycnsisitin A能增强转铁蛋白与TFRC的结合能力，从而增加心肌铁含量。功能性阻断TFRC的实验则证实了这一机制，消除了Glycnsisitin A在体内外的心脏保护作用。
综上所述，Glycnsisitin A作为一种新型双环肽，具有成为治疗HF特别是铁缺乏性HF的潜在候选药物的巨大潜力。Glycnsisitin A通过维持心肌铁稳态和增强转铁蛋白与TFRC的结合能力，对DOX诱导的心力衰竭具有显著的保护作用。这一发现为心力衰竭的治疗提供了新的潜在药物候选和分子机制。进一步的研究可以聚焦于Glycnsisitin A的生物合成途径、药代动力学特性和安全性评估，以推动其向临床应用的转化。
【文章信息】
发表时间：2024年2月
期刊：Acta Pharmaceutica Sinica B
影响因子：IF=14.7
最高JCR分区/中科院分区：Q1 医学、化学大类1区
题目：Glycnsisitin A: A promising bicyclic peptide against heart failure that facilitates TFRC-mediated uptake of iron in cardiomyocytes
DOI：10.1016/j.apsb.2024.02.026
【期刊介绍】
Acta Pharmaceutica Sinica B （APSB）发表重要的原创研究文章、快速交流和对药学所有领域最新进展的高质量评论，包括药理学、药学、药物化学、天然产物、生药学、药物分析和药代动力学。
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